Το εργαστηριακό στάδιο μιας εξωσωματικης γονιμοποιησης.   

Το εργαστηριακό στάδιο της διαδικασίας  

Κλασική εξωσωματική γονιμοποίηση

Το στάδιο αυτό είναι το κυρίως εργαστηριακό στάδιο της προσπάθειας. Μερικές ώρες μετά την ωοληψία, ο εμβρυολόγος τοποθετεί συγκεκριμένο αριθμό ενεργοποιημένων σπερματοζωαρίων σε κάθε τρυβλίο καλλιέργειας που περιέχει τα ωάρια μέσα σε θρεπτικό καλλιεργητικό υλικό. Στην κλασική εξωσωματική
γονιμοποίηση δεν πραγματοποιείται άλλη παρέμβαση. Τα σπερματοζωάρια έρχονται σε επαφή με το ωάριο μόνα τους και ένα από αυτά διεισδύει μέσα του και το γονιμοποιεί.
Μικρογονιμοποίηση

Σε περιπτώσεις που το σπερματοζωάριο αδυνατεί να γονιμοποιήσει το ωάριο μόνο του (όπως περιγράφεται προηγούμενα), εφαρμόζεται η μικρογονιμοποίηση, που σημαίνει ενδοωαριακή έγχυση σπερματοζωαρίου (ICSI,intra-cytoplasmic sperm injection). Ο εμβρυολόγος επεμβαίνει με μικροχειρισμό και με τη βοήθεια ειδικού εξοπλισμού τοποθετεί το σπερματοζωάριο μέσα στο ωάριο για να γίνει η γονιμοποίηση. Χρειάζεται μόνον ένα κινητό σπερματοζωάριο ανά ώριμο ωάριο.
Η μέθοδος εφαρμόζεται με επιτυχία από το 1992 και είναι κατανοητό ότι παρακάμπτει σχεδόν στο σύνολό τους τα αίτια υπογονιμότητας που σχετίζονται με τον άνδρα. Χάρη στη μικρογονιμοποίηση μπορούν να γίνουν πατέρες, άνδρες με σοβαρά προβλήματα στην ποιότητα του σπέρματος (μειωμένος αριθμός, χαμηλή κινητικότητα, κακή μορφολογία ή προβλήματα εκσπερμάτισης), που στο πρόσφατο παρελθόν δεν είχαν καμία τέτοια ελπίδα. Μέχρι σήμερα, από χιλιάδες παιδιά που έχουν γεννηθεί με αυτόν τον τρόπο, δεν υπάρχει ένδειξη ότι η μικρογονιμοποίηση δημιουργεί κινδύνους για την ποιότητα των εμβρύων και για την υγεία των παιδιών (πρόσφατη μεγάλη επιδημιολογική μελέτη από το Βέλγιο).
Αν εξαιρέσει κανείς τον τρόπο γονιμοποίησης, η διαδικασία είναι ίδια ακριβώς με την κλασική μέθοδο τόσο για τη γυναίκα όσο και τον άνδρα.

Έλεγχος γονιμοποίησης

Το επόμενο πρωινό, δηλαδή μετά από 16-20 ώρες παραμονής των ωαρίων και σπερματοζωαρίων σε συνθήκες καλλιέργειας, γίνεται ο έλεγχος της γονιμοποίησης. Ο εμβρυολόγος παρατηρεί στο μικροσκόπιο και καταγράφει πόσα ωάρια έχουν γονιμοποιηθεί φυσιολογικά, ενώ απομονώνει τα ανωμάλως γονιμοποιηθέντα (π.χ. πολυσπερμικά). Τα πολυσπερμικά έμβρυα δεν πρέπει να μεταφέρονται στη μήτρα, διότι ενοχοποιούνται για παθολογικές κυήσεις (αποβολές, μύλη).
Τα φυσιολογικά έμβρυα τοποθετούνται και πάλι σε καλλιέργεια και συνεχίζουν να αναπτύσσονται. Σε όλο το διάστημα παραμονής τους στο εργαστήριο (συνήθως για 2 ή 3 ημέρες) ελέγχεται περιοδικά η ομαλή εξέλιξή τους.

Αξιολόγηση των εμβρύων

Η επίτευξη εγκυμοσύνης εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από τον αριθμό και την ποιότητα των εμβρύων που θα μεταφερθούν στην κοιλότητα της μήτρας. Επομένως, χρειάζεται να κατατάξουμε τα έμβρυα καθώς αναπτύσσονται και να επιλέξουμε, αμέσως πριν την εμβρυομεταφορά, εκείνα που συγκεντρώνουν τα περισσότερα ποιοτικά χαρακτηριστικά.
Η αξιολόγηση και επιλογή των εμβρύων γίνεται με βάση δύο μορφολογικά κριτήρια: αφ' ενός τη διαίρεση των εμβρύων σε κύτταρα (βλαστομερίδια) και αφ' ετέρου τη μορφολογική εμφάνιση των κυττάρων αυτών.
Διαίρεση: τη δεύτερη ημέρα μετά την ωοληψία τα έμβρυα θα πρέπει να έχουν διαιρεθεί σε 2-4 κύτταρα (βλαστομερίδια). Καλύτερα θεωρούνται τα έμβρυα των 4 κυττάρων, ενώ αυτά των 2 κυττάρων θεωρούνται «αργοπορούντα» έμβρυα. Την τρίτη ημέρα τα έμβρυα πρέπει να έχουν φτάσει στο στάδιο των 5-8 κυττάρων. Καλύτερα
θεωρούνται τα έμβρυα με 8 κύτταρα και οριακά αυτά των 5 κυττάρων.
Μορφολογία: στην «Ευγονία» κατατάσσουμε τα έμβρυα στις κατηγορίες Ι έως IV. Καλύτερη μορφολογία θεωρείται η Ι που περιλαμβάνει έμβρυα χωρίς θρυμματισμό και κανονικό σχήμα των βλαστομεριδίων (σφαιρικό ή ατρακτοειδές). Η κατηγορία IV περιλαμβάνει έμβρυα με έντονο θρυμματισμό. Τα «αργοπορούντα» έμβρυα, όπως και εκείνα με πολύ θρυμματισμό, έχουν στατιστικά σημαντικά μειωμένη πιθανότητα επιτυχίας κυήσεως. Έτσι, ιδανικά έμβρυα για εμβρυομεταφορά τη δεύτερη μέρα μετά την ωοληψία θεωρούνται τα έμβρυα 4 κυττάρων κατηγορίας Ι-ΙΙ, ενώ αντίστοιχα για την τρίτη ημέρα τα έμβρυα 8 κυττάρων κατηγορίας Ι-ΙΙ. (Βλέπε αναφορά στην ενότητα: «Εξωσωματική γονιμοποίηση»).

Καλλιέργεια βλαστοκύστεων

Ο όρος βλαστοκύστη αναφέρεται σε ένα συγκεκριμένο στάδιο ανάπτυξης του εμβρύου, μετά από 5-6 ημέρες καλλιέργειας. Στο στάδιο αυτό, το έμβρυο αποτελείται από 60-120 κύτταρα, τα οποία σχηματίζουν δύο διακριτές ομάδες: την έξω κυτταρική μάζα, από την οποία θα σχηματιστεί ο πλακούντας και την έσω κυτταρική μάζα, από την οποία θα σχηματιστεί το κυρίως έμβρυο. Η διαδικασία της εμβρυομεταφοράς βλαστοκύστεων (5η ή 6η ημέρα μετά την ωοληψία) είναι όμοια με εκείνη της 2ης και 3ης ημέρας, που περιγράφεται παρακάτω.

Γιατί οι βλαστοκύστεις δεν προτείνονται ως πρακτική ρουτίνας

Είναι γνωστό ότι μόνο μερικά έμβρυα φτάνουν στο στάδιο της βλαστοκύστης υπό συνθήκες εργαστηριακής καλλιέργειας. Σύμφωνα με διεθνείς στατιστικές, το ποσοστό αυτό υπολογίζεται περίπου στο 20-40% των ωαρίων που γονιμοποιήθηκαν. Αυτό μπορεί να οφείλεται είτε στη διαφορετική δυναμική ανάπτυξης των εμβρύων, είτε στο ότι τα σημερινά καλλιεργητικά υλικά δεν επαρκούν για να καλύψουν απόλυτα τις αυξημένες μεταβολικές ανάγκες (διατροφή-απέκκριση) ενός εμβρύου 60-120 κυττάρων (βλαστοκύστη), ενώ αντίθετα καλύπτουν ικανοποιητικά τις μεταβολικές ανάγκες ενός εμβρύου 2, 4 ή 8 κυττάρων. Επομένως, αν ένα έμβρυο δεν φτάσει σε βλαστοκύστη δεν γνωρίζουμε με βεβαιότητα τον λόγο. Δεν έφτασε γιατί δεν είχε δυναμική, ή γιατί του τη στέρησαν οι συνθήκες καλλιέργειας; Αυτοί είναι οι λόγοι που η καλλιέργεια και η εμβρυομεταφορά βλαστοκύστεων έχουν συγκεκριμένο πεδίο εφαρμογών.
Σε καλά οργανωμένες Μονάδες υπάρχει επιτυχές πρόγραμμα καλλιέργειας και εμβρυομεταφοράς βλαστοκύστεων, με συγκεκριμένες ενδείξεις, διεθνώς αποδεκτές. Το επιστημονικό δυναμικό της Μονάδας έχει τη γνώση και την εμπειρία για να σας ενημερώσει και να σας κατευθύνει σχετικά.
Υποβοηθούμενη εκκόλαψη (assisted hatching)

Κατά τη φυσιολογική διεργασία της σύλληψης, οι βλαστοκύστεις εκκολάπτονται από το περίβλημά τους, τη διαφανή ζώνη, την 5η ή 6η ημέρα μετά τη γονιμοποίηση. Η βλαστοκύστη που έχει εκκολαφθεί πλήρως από τη διαφανή ζώνη είναι η τελευταία ελεύθερη μορφή του εμβρύου και η μόνη που έχει την ικανότητα να προσκολληθεί στο
ενδομήτριο και να εμφυτευθεί. Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις, η διαφανής ζώνη είναι σκληρή, ή παχύτερη του φυσιολογικού, με συνέπεια να παρεμποδίζεται η εκκόλαψη, άρα και η εμφύτευση. Όταν όμως τα έμβρυα βρίσκονται σε καλλιέργεια και πριν μεταφερθούν στη μητρική κοιλότητα, υπάρχει δυνατότητα για άλλη μια παρέμβαση: ο εμβρυολόγος μπορεί να υποβοηθήσει τεχνητά την εκκόλαψη της βλαστοκύστης, ανοίγοντας μια οπή στη διαφανή ζώνη κάθε εμβρύου. Αυτό επιτυγχάνεται είτε με ειδικό laser, είτε με ένα χημικό διάλυμα.
Ο αρχικός ενθουσιασμός για τη χρησιμότητα της υποβοηθούμενης εκκόλαψης στην εμφύτευση δεν έχει γίνει αποδεκτός από τους περισσότερους εμβρυολόγους διεθνώς. Η μέθοδος αυτή φαίνεται ότι δεν αυξάνει θεαματικά τα ποσοστά επιτυχίας, ενώ υποβάλλει τα έμβρυα σε μία επί πλέον ταλαιπωρία, χωρίς ιδιαίτερο λόγο. Ωστόσο, σε ειδικές περιπτώσεις (εξαιρετικά παχιά ζώνη, έμβρυα που προέρχονται από απόψυξη, ωάρια γυναικών μεγάλης ηλικίας, κ.λπ.), η υποβοηθούμενη εκκόλαψη έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει κατά τι την πιθανότητα εμφύτευσης.
Προεμφυτευτική γενετική διάγνωση

Είναι μέθοδος που επιτρέπει την ανίχνευση γενετικών ανωμαλιών του εμβρύου, όσο αυτό αναπτύσσεται σε συνθήκες καλλιέργειας στο εμβρυολογικό εργαστήριο.
Αναζητούνται συγκεκριμένες αριθμητικές ή δομικές χρωμοσωματικές βλάβες που είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση στο έμβρυο γνωστών, συγγενών και κληρονομικών νοσημάτων.
Τα προσβεβλημένα έμβρυα απομονώνονται και αποκλείονται από την εμβρυομεταφορά. Στη μήτρα μεταφέρονται επιλεκτικά μόνον τα υγιή. Αν το παθολογικό γονίδιο βρίσκεται σε χρωμόσωμα που καθορίζει το φύλο, για να αποκλειστεί το νόσημα γίνεται επιλογή του φύλου στο
έμβρυο. Διευκρινίζεται ότι επιλογή του φύλου γίνεται αποκλειστικά και μόνο για τέτοιες περιπτώσεις. Παραδείγματα ασθενειών που εφαρμόζεται η προεμφυτευτική γενετική διάγνωση είναι η β-μεσογειακή αναιμία, η κυστική ίνωση, το σύνδρομο Όοννη κ.ά. Η προεμφυτευτική γενετική διάγνωση πλεονεκτεί σε σχέση με τις συνήθεις μεθόδους προγεννητικού ελέγχου, δηλαδή την αμνιοπαρακέντηση και τη βιοψία τροφοβλάστης, γιατί αποφεύγεται το ενδεχόμενο διακοπής της κυήσεως αν ο έλεγχος δώσει θετικά αποτελέσματα για τη συγκεκριμένη πάθηση του εμβρύου. Πρέπει να γίνει σαφές ότι η μέθοδος αναζητά συγκεκριμένα νοσήματα και δεν αποκλείει τη γέννηση ενός παιδιού με άλλης μορφής γενετική βλάβη.
Επίσης, οι περιπτώσεις επανειλημμένων αποτυχημένων προσπαθειών εξωσωματικής γονιμοποίησης μπορούν να μελετηθούν προεμφυτευτικά. Με ειδική τεχνική είναι δυνατόν να αποκαλυφθούν αλλοιώσεις των γεννητικών κυττάρων που σηματοδοτούν τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατό τους (απόπτωση).